Sediaan Apusan Darah Tepi

 

SEDIAAN APUS DARAH TEPI

Pada postingan kali ini, saya akan menjelaskan Sediaan Apus Darah Tepi dengan kalimat yang mudah dimengerti. 

Meskipun beberapa automated analyzer menyediakan pewarnaan apusan darah sesuai dengan kriteria yang ditetapkan, persiapan apusan darah tepi manual masih digunakan di banyak tempat. Teknik ini membutuhkan setidaknya dua object glass (3 × 1-inch (75 × 25-mm)) bersih. 

Pembuatan SEDIAAN APUS DARAH TEPI

Satu slide berfungsi sebagai preparat apusan darah dan yang lainnya sebagai slide pendorong (saya biasa menyebutnya spreader slide). Setetes darah EDTA (antikoagulan asam etilendiamintetraasetat) berdiameter sekitar 3 mm ditempatkan di salah satu sisi preparat apusan darah (dengan posisi ditengah). Ukuran dari setetes darah itu penting. Tetesan yang terlalu besar akan menghasilkan apusan yang panjang atau tebal, dan tetesan yang terlalu kecil sering membuat apusan pendek atau tipis.  Dalam menyiapkan apusan, analis memegang spreader slide, geser dengan aman di depan tetesan darah pada sudut 30 hingga 45 derajat ke preparat apusan

GAMBAR 1-1 Teknik membuat apusan darah tepi.  A, Sudut yang benar untuk menahan  spreader slide.  B, Darah menyebar di seluruh lebar spreader slide.  C, apusan darah tepi selesai. (Rodak BF, Fritsma GA, Keohane EM: Hematology: clinical principles and applications, ed 4, St. Louis, 2012, Saunders.)

Sebagai catatan:

• Spreader slide ditarik mundur ke setetes darah dan ditahan di posisi itu sampai darah menyebar melintasi lebar spreader slide
• Kemudian dengan cepat dan lembut, spreader slide didorong ke depan, ke arah sisi preparat apusan yang satunya, membuat apusan darah tepi
• Menggerakan slider terlalu lambat akan menyebabkan distribusi leukosit yang buruk dengan mendorong sel yang lebih besar, seperti: monosit dan granulosit, hingga ujung dan sisi apusan.

Menjaga konsistensi sudut antar slide dan tekanan yang merata mejadi hal yang sangat penting.  Hal ini sering diperlukan untuk sesuaikan sudut antar slide agar menghasilkan apusan yang memuaskan.  Untuk hematokrit yang lebih tinggi dari biasanya, sudut antar slide harus diturunkan agar apusan tidak terlalu pendek dan tebal.  Untuk hematokrit yang sangat rendah, sudut harus dinaikkan.  apusan darah tepi yang dibuat dengan baik (Gambar 1-2) memiliki ciri-ciri sebagai berikut:

GAMBAR 1-2 Darah tepi yang dibuat dengan baik. (Rodak BF, Fritsma GA, Keohane EM: Hematology: clinical principles and applications, ed 4, St. Louis, 2012, Saunders.)

1. Sekitar dua pertiga sampai tiga perempat panjang kaca objek tertutup oleh apusan.
2. Ujung apusan agak membulat (bagian tipis), tidak berbentuk peluru.
3. Tepi lateral apusan harus terlihat.  Kemiringan yang tepat pada spreader slide sangat dibutuhkan untuk mendapatkan hasil yang maksimal.
4. Halus tanpa penyimpangan, lubang, atau coretan.
5. Saat kaca objek diangkat ke atas cahaya, akan tampak pelangi pada bagian tipis apusan

Gambar 1-3 menunjukkan contoh apusan yang kurang baik (Rodak BF, Fritsma GA, Keohane EM: Hematology: clinical principles and applications, ed 4, St. Louis, 2012, Saunders.)

Tampilan slide yang terkait dengan kesalahan paling umum, tetapi perhatikan bahwa banyak hal yang menyebabkan terbentuknya preparat yang kurang baik. 

A. Bagian tepi kasar atau terkelupas. 

B. Keragu-raguan dalam menggerakan spreader slide. 

C. Spreader slide didorong terlalu cepat. 

D. Tetesan darah terlalu sedikit. 

E. Tetesan darah tidak menyebar di sepanjang lebar spreader slide. 

F. Kotoran atau minyak pada slide; dan  juga dapat disebabkan oleh peningkatan lipid dalam spesimen darah.

G. Tekanan yang tidak merata pada spreader slide. 

H. Terlalu lama menunda sehingga tetesan darah mulai mengering.

Pewarnaan SEDIAAN APUS DARAH TEPI

Tujuan dari pewarnaan apusan darah tepi adalah untuk mengidentifikasi sel dan mengenali morfologi dengan mudah melalui mikroskop.  Pewarnaan Wright atau Wright Giemsa adalah pewarnaan yang paling umum digunakan untuk apusan darah tepi dan sumsum tulang. Pewarnaan ini mengandung eosin dan methylene blue, dan oleh karenanya disebut pewarnaan polikrom.  Warnanya sedikit berbeda dari satu laboratorium ke laboratorium lainnya, tergantung pada metode pewarnaan. Sebelum melakukan pewarnaan,sebaiknya preparat difiksasi dengan metanol.

Reaksi pewarnaan dipengaruhi pH, dan pewarnaan sebenarnya dari komponen sel terjadi ketika buffer (pH 6,4) ditambahkan ke zat warna.  Free methylene blue  bersifat basa dan mewarnai komponen sel yang bersifat asam, seperti RNA, menjadi biru.  Free eosin bersifat asam dan mewarnai komponen dasar, seperti hemoglobin atau granula eosinofilik, menjadi merah.  Neutrofil memiliki granula sitoplasmik yang memiliki pH netral dan menerima beberapa karakteristik dari kedua warna, sehingga menjadi ungu.  Detail untuk metode tertentu pewarnaan darah tepi dan apusan sumsum tulang, termasuk metode otomatis, dapat ditemukan dalam buku teks standar hematologi.

GAMBAR 1-4 Apusan darah tepi yang diwarnai secara optimal menunjukkan area yang sesuai untuk melakukan penilaian diferensial dan morfologi sel darah putih dan perkiraan trombosit.  Hanya bagian tengah bidang yang ditampilkan;  seluruh bidang akan berisi 200 hingga 250 sel darah merah (1000X).

Apusan yang diwarnai secara optimal (Gambar 1-4) memiliki karakteristik sebagai berikut:

 1. Sel darah merah (RBC) harus berwarna merah muda.

 2. Nukleus berwarna biru tua hingga ungu.

 3. Granula sitoplasma neutrofil berwarna lavender hingga ungu.

 4. Granula sitoplasma basofil berwarna biru tua sampai hitam.

 5. Granula sitoplasma eosinofil berwarna merah hingga jingga.

 6. Area antar sel harus tidak berwarna, bersih, dan bebas dari endapan zat warna.

Preparat yang diwarnai dengan baik diperlukan untuk interpretasi morfologi sel yang akurat. hasil pewarnaan terbaik diperoleh dari preparat yang baru dibuat, dengan stabilitas spesimen darah 2-3 jam sejak pengambilan darah.  Sediaan apusan darah tepi harus dibiarkan kering secara menyeluruh sebelum diwarnai.

Pembacaan SEDIAAN APUS DARAH TEPI

Lapang Pandang Kecil

Pemeriksaan apusan darah merupakan proses yang bertingkat.  Mulailah pembacaan sediaan apus darah tepi dengan membaca sediaan menggunakan perbesaran 10X atau Lapang Pandan Kecil (Jika dijumlahkan dengan perbesaran lensa okuler,maka total perbesaran = 100X).  Langkah ini diperlukan untuk menilai kualitas apusan secara keseluruhan, termasuk distribusi eritrosit yang abnormal, menunjukkan adanya rouleaux atau autoaglutinasi dan/atau adanya jumlah sel berinti besar yang tidak proporsional, seperti monosit atau neutrofil, di tepi apusan.  Jika ditemukan hal-hal tersebut, maka perlu menyiapkan apusan lain sebagai pembanding.  Selain itu, pemeriksaan apusan 10X memungkinkan deteksi cepat sel abnormal besar seperti blas, limfosit reaktif, dan parasit.

Lapang pandang Besar

Dengan menggunakan objektif 40X (total perbesaran 400X), temukan area apusan di mana eritrosit tersebar merata dan hampir tidak saling bersentuhan (dua atau tiga sel  mungkin tumpang tindih; Gambar 1-5). 

GAMBAR 1-5 Area apusan darah yang benar untuk mengevaluasi distribusi seluler dan melakukan estimasi leukosit (400X).

Baca 8 hingga 10 bidang di area apusan ini dan tentukan jumlah rata-rata leukosit (leukosit) per bidang.  Meskipun banyak faktor penyebab yang bervariasi tergantung merek dan model mikroskop, secara umum, perkiraan jumlah WBC per milimeter kubik dapat ditentukan dengan mengalikan jumlah rata-rata leukosit per Lapang Pandang Besar dengan 2000.  Perkiraan ini adalah quality control yang berguna untuk memvalidasi jumlah WBC dari hematology analyzer.  Setiap perbedaan antara jumlah WBC dari alat dan perkiraan pada pembacaan preparat apusan, perlu didiskusikan, yang mungkin karena berbagai alasan termasuk adanya gumpalan trombosit, benang fibrin, aglutinasi eritrosit yang parah, giant trombosit, serta apusan yang salah label, apusan yang dibuat dari sampel pasien yang salah, dan  suatu kegagalan fungsi instrumen.

 Lapang Pandang Imersi

Langkah selanjutnya adalah melakukan Hitung Jenis Leukosit.  Hal ini dilakukan di area apusan yang sama dengan perkiraan WBC tetapi menggunakan objektif 100X minyak imersi (total perbesaran 1000X).  Ketika area apusan yang benar dari pasien dengan jumlah eritrosit normal dilihat, akan tampak sekitar 200 hingga 250 eritrosit per Lapang Pandang Imersi (lihat Gambar 1-4).

Secara karakteristik, hitung jenis leukosit mencakup penghitungan dan pengklasifikasian 100 leukosit berturut-turut dan melaporkan jenis-jenis leukosit ini sebagai persentase.  Penghitungan diferensial dilakukan secara sistematis secara zig-zag (Gambar 1-6), yang meminimalkan kesalahan distribusi WBC. Hasilnya  dilaporkan sebagai persentase dari setiap jenis leukosit yang terlihat selama penghitungan.  Contoh dari hitung jenis leukosit adalah 3% Neutrofil batang, 55% neutrofil segmen, 30% limfosit, 6% monosit, 4% eosinofil, dan 2% basofil (Tabel 1-1). 

GAMBAR 1–6 Pola zig-zag untuk melakukan hitung jenis leukosit.

Jika ada, eritrosit berinti (NRBC) dihitung dan dilaporkan sebagai  jumlah NRBC per 100 leukosit.  RBC, WBC, evaluasi morfologi trombosit, dan perkiraan trombosit juga dilakukan di bawah perbesaran 100X minyak imersi.  Setiap laboratorium harus menetapkan protokol standar pelaporan kelainan.

Evaluasi morfologi eritrosit merupakan aspek penting dari evaluasi apusan dan digunakan bersama dengan indeks eritrosit untuk menggambarkan sel sebagai normal atau abnormal dalam ukuran, bentuk, dan warna.  Setiap laboratorium harus menetapkan protokol pelaporan standar.  Sebagian besar laboratorium menggunakan pernyataan singkat yang menjelaskan morfologi eritrosit secara keseluruhan yang konsisten dengan indeks eritrosit.  Evaluasi mikroskopis morfologi eritrosit harus sesuai dengan informasi yang diberikan oleh automated hematology analyzer.  Jika tidak, perbedaan hasil harus segera didiskusikan sebelum melaporkan hasil pasien.

Langkah terakhir dalam pembacaan sediaan apus darah tepi adalah estimasi jumlah trombosit.  Hal ini dilakukan di bawah perbesaran 100X minyak imersi.  Di area apusan di mana eritrosit hampir tidak bersentuhan, hitung jumlah trombosit di 5 hingga 10 Lapang Pandang Imersi.  Jumlah rata-rata trombosit dikalikan dengan 20.000 untuk memberikan perkiraan jumlah total trombosit per milimeter kubik.  Perkiraan ini dilaporkan memadai jika perkiraan konsisten dengan jumlah trombosit normal, menurun jika di bawah batas bawah normal untuk laboratorium tersebut, dan meningkat jika di atas batas atas normal. 

Perkiraan tersebut dapat dibandingkan dengan jumlah trombosit pada hematology analyzer sebagai quality control tambahan.  Jika perkiraan dan jumlah trombosit dari alat tidak sesuai, maka perlu didiskusikan.  Beberapa penyebab perbedaan termasuk adanya giant trombosit, dan banyak schistocytes.

 

RINGKASAN

Sejumlah besar informasi berharga dapat diperoleh dari apusan darah tepi yang disiapkan, diwarnai, dan dievaluasi dengan benar.  Banyak laboratorium menggunakan apusan yang dibuat dari darah antikoagulan EDTA dan diwarnai dengan pewarnaan Wright atau WrightGiemsa.  Apusan harus dievaluasi secara sistematis menggunakan pertama 10X LPK, kemudian 40X LPB dan akhirnya 100X LPi pada mikroskop.

Sumber : Clinical Hematology Fourth Edition by Bernadette F. Rodak and Jacqueline H. Carr.